Evolusi Enzim NAD+-Dependent yang Kuat dengan Bantuan Mikrofluida dengan Toleransi Isobutanol yang Lebih Baik pada Suhu Tinggi

Abstrak
Didorong oleh masalah termostabilitas yang diidentifikasi dalam karya terbaru tentang penemuan/rekayasa enzim dan aplikasinya, kami menjelaskan di sini evolusi terarah dari aldehida dehidrogenase (ALDH) yang bergantung pada NAD+ dengan termostabilitas yang ditingkatkan dan toleransi isobutanol pada 50 °C, sifat-sifat yang diperlukan untuk implementasinya yang berhasil dalam biosintesis isobutanol bebas sel. ALDH memainkan peran penting dalam kaskade multi-enzim untuk produksi bahan kimia platform, tetapi juga merupakan hambatan karena stabilitasnya yang sederhana. Dengan menggunakan sorter tetesan yang diaktifkan oleh absorbansi yang dibuat khusus, penyaringan mikrofluida dengan hasil sangat tinggi dari pustaka acak yang terdiri dari 63.000 anggota dilakukan, yang mengarah pada penemuan varian dengan waktu paruh yang diperpanjang 250 kali lipat pada 50 °C tanpa kehilangan aktivitas yang signifikan. Selanjutnya, mutasi yang paling menjanjikan didistribusikan pada templat desainer dalam pustaka proses ekstensi terhuyung-huyung kombinatorial untuk membuat varian generasi baru. Salah satu varian ini menunjukkan peningkatan tiga kali lipat dalam kcat Km−1. Varian lain menunjukkan stabilitas yang jauh lebih tinggi dalam isobutanol 3% (v/v), mempertahankan ~50% dari aktivitas awalnya setelah enam jam inkubasi pada suhu 50 °C. Terakhir, kaskade multienzimatik bebas sel menggunakan varian terakhir menunjukkan stabilitasnya yang unggul dalam isobutanol 4% (v/v) pada suhu 50 °C, yang menyoroti keberhasilan rekayasa untuk mengatasi tantangan terkait kofaktor dalam membangun keseimbangan kaskade.