ABSTRAK
Biokatalisis industri, industri bernilai miliaran dolar, bergantung pada selektivitas dan kemanjuran enzim untuk transformasi kimia yang efisien. Namun, enzim, yang secara evolusi beradaptasi dengan kondisi biologis ringan, sering kali mengalami kesulitan dalam proses industri yang memerlukan kondisi reaksi yang keras, sehingga mengakibatkan berkurangnya stabilitas dan aktivitas. Imobilisasi enzim, yang mengatasi tantangan seperti penggunaan kembali dan stabilitas enzim, karenanya telah menjadi strategi penting untuk meningkatkan penggunaan enzim dalam aplikasi industri. Teknik imobilisasi tradisional bergantung pada pembatasan atau tampilan enzim di dalam/pada pendukung organik atau anorganik, sementara kemajuan terkini dalam biologi sintetis telah mengarah pada pengembangan metode imobilisasi in vivo biologis semata yang menyederhanakan produksi dan imobilisasi enzim. Metode ini menawarkan manfaat tambahan dalam hal keberlanjutan dan efisiensi biaya. Selain itu, pengembangan dan penggunaan bahan multifungsi, seperti bahan magnetik (nano) untuk imobilisasi enzim, telah memungkinkan proses pemisahan dan pemurnian yang lebih baik. Kombinasi kedua “dunia” tersebut membuka jalan baru dalam biokatalisis (industri), sains fundamental, dan biomedis. Oleh karena itu, dalam tinjauan ini, kami memberikan tinjauan umum metode yang sudah mapan dan baru muncul untuk pembuatan imobilisasi protein magnetik, dengan fokus khusus pada solusi imobilisasi in vivo.
1 Pendahuluan
Pemanfaatan mikroba, dan secara tidak langsung enzim, untuk transformasi kimia sudah ada sejak peradaban manusia. Sejak sekitar 10.000 M, manusia, meskipun sebagian besar waktu itu tidak menyadarinya, telah menggunakan fermentasi mikroba untuk memproduksi minuman beralkohol seperti bir dan anggur, serta produk makanan seperti roti, keju, dan yogurt [1-4]. Saat ini, biokatalisis industri merupakan industri bernilai miliaran dolar [5], memanfaatkan selektivitas enzim yang tinggi yang sering kali memungkinkan transformasi kimia dengan kemo-, regio-, dan stereoselektivitas yang tinggi [6, 7]. Selain itu, menurut definisi, enzim sebagai makromolekul yang diproduksi secara biologis merupakan sumber daya yang dapat diperbarui dan terurai secara hayati [8, 9], yang penggunaan industrinya dapat berkontribusi pada pengelolaan sumber daya yang berkelanjutan, khususnya, jika diproduksi dengan menumbuhkan strain inang produksi masing-masing (yang sering kali berupa bakteri atau ragi) pada sumber daya terbarukan yang murah. Sementara enzim sebagai katalis biologis secara evolusioner beradaptasi dengan kondisi reaksi ringan dan lingkungan berair, proses industri sering kali menuntut kondisi yang keras, termasuk suhu tinggi, nilai pH ekstrem, dan keberadaan pelarut organik [10-12]. Namun, kondisi seperti itu membuat enzim tidak stabil, yang mengakibatkan inaktivasi cepat dan dengan demikian pada dasarnya mengurangi hasil produk. Oleh karena itu, mengingat keberlanjutan dan penggunaan enzim yang efisien secara komersial, sangat penting untuk mendapatkan sediaan enzim yang sangat stabil, mudah ditangani dan digunakan kembali, meningkatkan hasil ruang-waktu sekaligus mengurangi beban lingkungan yang terkait dengan produksinya. Imobilisasi enzim, yang melibatkan pembatasan satu atau lebih enzim dalam ruang yang ditentukan, awalnya dikembangkan pada pertengahan abad ke-20 terutama untuk mengatasi tantangan yang terkait dengan pemulihan dan penggunaan kembali enzim [13-17]. Namun, hal itu sering kali juga mengarah pada stabilisasi enzim [18], menjadikan imobilisasi enzim sebagai strategi penting yang dapat meningkatkan penggunaan enzim secara industri. Pendekatan konvensional untuk melumpuhkan enzim memerlukan pembatasan enzim di dalam atau menempelkannya pada bahan pembawa anorganik atau organik. Seiring berjalannya waktu, banyak sekali bahan dan strategi imobilisasi telah dirancang untuk mencapai tujuan ini [13]. Sebagai alternatif, enzim dapat diimobilisasi dengan membuatnya tidak larut dalam air, misalnya, dengan kristalisasi/agregasi yang diikuti oleh ikatan silang, menghasilkan kristal enzim ikatan silang (CLEC) dan agregat enzim ikatan silang (CLEA) [15, 19].
Dalam beberapa tahun terakhir, seiring dengan revolusi biologi sintetis, semakin banyak metode imobilisasi biologis in vivo yang dikembangkan yang memungkinkan produksi dan imobilisasi enzim secara bersamaan dalam satu langkah, yaitu, selama produksi berlebih heterolog dari enzim target [9]. Dalam hal keberlanjutan dan biaya, penggunaan imobilisasi yang dihasilkan secara in vivo menguntungkan, karena produksinya tidak memerlukan langkah kerja tambahan (misalnya, ikatan silang atau penyerapan) atau, seringkali bahan pembawa yang berasal dari bahan kimia, yang produksinya dapat mencapai sekitar 50% dari biaya yang terkait dengan imobilisasi enzim [20]. Biasanya, enzim target direkayasa dengan menggabungkannya dengan modul protein lain. Penggabungan ini memfasilitasi perakitan mandiri protein fusi rekombinan menjadi struktur supramolekuler berukuran nano atau mikrometer di dalam sel (mikroba) atau memungkinkan perlekatan pada bahan pembawa/perancah biogenik yang diproduksi bersama [9]. Tren lain yang terlihat dalam beberapa tahun terakhir adalah penggunaan bahan imobilisasi yang memiliki fungsi tambahan, seperti, misalnya, bersifat magnetis, yang memungkinkan pemisahan magnetik, pemurnian [21], dan pencampuran mudah di dalam bioreaktor [22], atau bahkan respons stimulus untuk mengendalikan fungsi katalis dengan cahaya, suhu, atau medan magnet [23-26]. Secara khusus, imobilisasi enzim di dalam/pada nanomaterial magnetik dan manik-manik magnetik (MB) telah mengalami peningkatan aplikasi baru-baru ini [21, 27, 28]. Meskipun penggunaan MB dan nanomaterial magnetik telah berkembang melampaui disiplin akademis yang tidak jelas, dengan aplikasi yang ditemukan dalam biomedis, remediasi lingkungan (termasuk pengolahan air limbah) [29], dan industri minyak/energi [21], penggunaan imobilisasi enzim magnetik dalam kimia sintetis masih merupakan bidang yang sedang berkembang. Demikian pula, seperti yang diuraikan di atas, pendekatan biologi sintetis baru-baru ini memungkinkan pengembangan imobilisasi enzim magnetik yang diproduksi secara biologis [30-37].
Dengan tinjauan ini, oleh karena itu, kami berusaha untuk memberikan gambaran umum tentang strategi konvensional untuk imobilisasi enzim dengan fokus pada material magnetik (nano), mengeksplorasi solusi in vivo terkini untuk pembuatan imobilisasi enzim magnetik, menyoroti bidang aplikasi yang sedang berkembang dalam bioteknologi dan biomedis, dan menyarankan jalur penelitian masa depan berdasarkan keadaan terkini.
2 Metode Imobilisasi Enzim
Seperti yang disebutkan sebelumnya, terdapat banyak metode untuk imobilisasi enzim, yang dapat diklasifikasikan ke dalam tiga kategori berikut jika penggunaan bahan pembawa dan sifat in vivo/ex vivo dari metode tersebut dipertimbangkan: (i) metode ex vivo, yang mengandalkan produksi dan pelepasan protein yang diinginkan (POI) dari sel, diikuti oleh pelekatan/pengurangan POI di dalam/pada bahan pembawa yang sesuai; (ii) metode ex vivo yang mengandalkan ikatan silang POI, di mana enzim target dilepaskan dari sel dan setelah ikatan silang berfungsi sebagai pembawa itu sendiri; dan terakhir, (iii) metode in vivo sepenuhnya yang tidak menggunakan pembawa tetapi mengandalkan biokonjugasi, di mana produksi dan imobilisasi POI terjadi sebagai satu langkah di dalam sel (Gambar 1). Sejalan dengan berbagai metode imobilisasi yang tersedia, terdapat juga banyak sumber dan ulasan yang sangat baik [38-42] yang menjelaskannya secara terperinci dengan fokus yang berbeda; yang berfokus pada bahan pembawa klasik dan baru-baru ini dikembangkan [43-48], aplikasi industri [39, 49-51], serta yang berfokus pada metode imobilisasi yang relatif lebih baru [9, 52–55]. Oleh karena itu, metode yang digambarkan pada Gambar 1 hanya akan diuraikan secara singkat di sini.
2.1 Metode Ex Vivo Vivo yang Bergantung pada Pembawa untuk Imobilisasi Enzim
Cara yang paling umum untuk melumpuhkan enzim adalah dengan menempel pada pembawa yang sesuai melalui penyerapan fisik atau pengikatan kovalen. Penyerapan fisik dapat bergantung pada interaksi hidrofobik, gaya van der Waal, atau interaksi ionik, dan oleh karena itu dianggap sebagai metode yang lembut dan reversibel [51, 56–58]. Pembawa yang memiliki ion bermuatan negatif/positif di permukaannya (misalnya, resin penukar anion, penyangga kationik teraminasi) atau bersifat hidrofobik (misalnya, resin oktadesil metakrilat atau poliakrilik) cocok untuk melumpuhkan POI melalui interaksi ionik atau hidrofobik. Kelemahan dari pendekatan ini adalah sering kali terjadi kebocoran enzim dari bahan penyangga [59].
Pengikatan kovalen, di sisi lain, menghasilkan perlekatan ireversibel POI ke permukaan pembawa dan dapat dicapai dengan mengikat silang residu permukaan enzim dan pembawa fungsional yang sesuai [39, 51, 57, 58]. Amina primer (N-terminus dan gugus ε-amino dari lisin) dan gugus tiol dari sistein umumnya digunakan untuk pengikatan kovalen. Misalnya, N-terminus POI dapat direaksikan dengan gugus aldehida di permukaan pendukung, yang kemudian diubah menjadi amina sekunder yang stabil dengan penambahan agen pereduksi (imobilisasi kovalen titik tunggal), dan residu lisin dapat membentuk ikatan kovalen dengan pendukung glioksil dalam kondisi basa (imobilisasi kovalen multititik). Dengan memodulasi residu yang terlibat dalam pengikatan kovalen, adalah mungkin untuk meminimalkan hilangnya aktivitas untuk POI; Namun, pengikatan kovalen sering kali menyebabkan perubahan konformasi yang tidak diinginkan pada situs aktif enzim, sehingga mengurangi aktivitas secara drastis [57, 58].
Pengikatan afinitas juga dapat digunakan untuk imobilisasi, di mana POI dipadukan dengan tag afinitas dan ditempelkan ke pembawa yang mengandung ligan afinitas komplementer. Tag afinitas tersebut dapat ditempelkan ke POI secara genetik (misalnya, tag His, tag Halo), atau ditambahkan pascatranslasi ke POI dengan cara kovalen (misalnya, biotin), di mana POI akan diimobilisasi ke pembawa melalui ligan yang sesuai (yaitu, Ni2+ yang dikelat asam nitrilotriasetat [NTA], ligan tag Halo, dan streptavidin, masing-masing) dengan cara yang sangat spesifik dan terarah [39, 60]. Namun, pengikatan afinitas dapat mahal, karena tingginya biaya bahan pembawa, dan dalam kasus di mana tag afinitas melekat secara genetik, pendekatan tersebut mungkin memerlukan pengoptimalan lebih lanjut agar tidak membahayakan aktivitas enzim [57].
Berbagai polimer (misalnya, sol-gel, hidrogel) atau matriks padat (misalnya, keramik berpori, karbon aktif) dapat digunakan untuk menjebak atau membungkus POI, di mana POI tetap tidak terikat tetapi dikelilingi oleh matriks semipermeabel yang dibentuk oleh penyangga polimer [57, 61]. Hal ini sering dicapai dengan mencampur enzim yang diisolasi secara langsung dengan larutan polimer atau penyangga berpori. Metode ini dapat diterapkan secara luas tetapi dapat mengalami kebocoran dan keterbatasan perpindahan massa [51].
Demikian pula, metode imobilisasi yang bergantung pada pembawa dapat digunakan secara kombinatorial, misalnya, bahan pembawa heterofungsional (misalnya, pembawa glioksil-agarosa, amino-epoksi) dapat memfasilitasi penyerapan awal POI diikuti oleh pengikatan kovalen, atau POI dapat diserap ke polimer berpori yang sesuai, yang kemudian menjebaknya [38, 39].
2.2 Metode Imobilisasi Enzim yang Bebas Pembawa, Ex Vivo
CLEA dan pendahulunya, CLEC, merupakan metode imobilisasi bebas pembawa, yang mengandalkan agen pengikat silang [62]. Dalam kasus CLEC, POI dimurnikan setelah dilepaskan dari sel, dikristalkan secara batch, dan selanjutnya diikat silang melalui glutaraldehida. Metode CLEC menghasilkan kristal enzim yang stabil dengan ukuran yang dapat disesuaikan sehingga cocok untuk berbagai aplikasi, namun, karena metode ini membutuhkan banyak tenaga kerja yang dikombinasikan dengan biaya yang tinggi, metode ini kemudian digantikan oleh CLEA.
CLEA diproduksi dengan mengendapkan POI tanpa mendenaturasinya (yaitu, dengan penggaraman pada pH optimal dan suhu rendah), diikuti dengan pengikatan silang, di mana gugus ε-amino reaktif dari lisin dari POI tetangga dihubungkan secara permanen [39, 41]. Sementara berbagai dialdehida dapat digunakan untuk tujuan ini, glutaraldehida adalah agen pengikat silang yang paling umum digunakan. Khususnya, berbagai POI dapat diikat silang dengan pendekatan ini, misalnya, multi-CLEA dan combi-CLEA masing-masing mengandung beberapa enzim untuk reaksi nonkaskade dan kaskade. Lebih jauh, CLEA dapat dikombinasikan dengan bahan pembawa, seperti silika, atau bahkan partikel magnetik (yang terakhir menghasilkan mCLEA, lihat Bagian 4.1.1), dengan menambahkan pembawa ke presipitasi enzim selama langkah pengikatan silang. Imobilisasi hibrida ini dapat disesuaikan lebih lanjut dan telah digunakan untuk berbagai aplikasi sebagaimana ditinjau oleh Sheldon [19], serta Costa dari perspektif produksi biodiesel [63].
2.3 Metode Imobilisasi Enzim yang Bebas Pembawa, In Vivo
Dalam beberapa tahun terakhir, imobilisasi enzim secara in vivo telah mendapatkan popularitas. Imobilisasi in vivo dicapai dengan memproduksi POI dengan cara yang tidak larut (atau dipisahkan fase) dalam sel hidup [9, 52–55]. Lebih khusus lagi, gen yang mengkode POI digabungkan dengan gen yang mengkode tag pemicu badan inklusi (IB) (badan inklusi aktif katalitik [CatIB]), biopolimer yang tidak larut (butiran polihidroksialkanoat [PHA]), kapsid virus (partikel mirip virus, VLP), kristal protein yang tidak larut (kristal Cry3aa), domain protein yang tidak teratur secara intrinsik (pemisahan fase cair-cair [LLPS]), atau POI ditampilkan pascatranslasi ke partikel protein yang tidak larut tersebut menggunakan motif interaksi protein (misalnya, SpyTag/SpyCatcher, kumparan E-/K-, sistem kumparan melingkar SYNZIP1/SYNZIP2 [64-66]). IB sering kali diproduksi dalam bakteri sebagai akibat dari ekspresi berlebihan gen rekombinan, misalnya, dalam E. coli. IB, yang sebagian besar terdiri dari protein agregat dan biasanya dikaitkan dengan kurangnya aktivitas, memiliki ukuran 50–800 nm dan merupakan partikel padat dan tidak larut dalam air [53]. Dengan demikian, mereka dapat dengan mudah dipulihkan setelah lisis sel melalui sentrifugasi, dan telah digunakan sebagai perancah tempat protein fungsional telah ditampilkan. Ini umumnya dicapai dengan menginduksi pembentukan IB melalui produksi berlebihan protein yang rentan terhadap agregasi (yaitu, polihidroksibutirat [PHB] sintase, domain pengikat selulosa [CBD] [54, 67, 68]), yang menyatu dengan tag umpan (yaitu, kumparan E heliks α bermuatan negatif, yang dapat membentuk kumparan melingkar dengan pasangannya yang kaya lisin (kumparan K), atau penggunaan domain umpan/mangsa ritsleting leusin). IB dengan domain umpan tersebut selanjutnya digunakan untuk “menangkap” POI yang menyatu dengan domain mangsa, yang menghasilkan “penempelan” pasca-translasi POI ke partikel IB yang tidak larut, yang kemudian dapat diisolasi.
CatIB [9, 52, 69, 70] merupakan bentuk khusus IB yang mempertahankan aktivitas katalitiknya. IB biasanya diproduksi melalui fusi genetik peptida/domain yang rentan terhadap agregasi dengan gen yang mengkode POI, yang kemudian diekspresikan dalam kondisi yang mendukung pembentukan IB, serta retensi aktivitas katalitik (suhu rendah, kekuatan induksi tinggi). CatIB, mirip dengan IB, dapat dipulihkan dengan mudah, dan POI yang dimasukkan ke dalam CatIB biasanya mempertahankan aktivitasnya sampai batas tertentu, tergantung pada enzim dan tag pemicu agregasi yang digunakan (yaitu, 1%–58% dari aktivitas enzim murni yang larut [71-73]). Penerapan yang luas, kemudahan produksi, kandungan protein yang tinggi dari imobilisasi, dan peningkatan stabilitas telah menjadikan metode CatIB sebagai pilihan populer untuk imobilisasi enzim dalam beberapa tahun terakhir. Contoh kasus CatIB termagnetisasi juga ada, yang dijelaskan di Bagian 4.1.1.
Granula PHA adalah biopolimer yang diproduksi oleh berbagai bakteri dan beberapa archaea sebagai unit penyimpanan energi alami. Granula ini terdiri dari inti hidrofobik yang dikelilingi oleh lapisan protein dengan ukuran berkisar antara 100 hingga 500 nm [9, 74]. Sintesis PHA bergantung pada tiga enzim berikut: asetil-CoA asetiltransferase (PhaA), asetoasetil-CoA reduktase (PhaB), dan PHA sintase (PhaC), di mana PhaC tetap melekat secara kovalen pada permukaan granula PHA setelah sintesis. Oleh karena itu, PhaC, yang sebagai protein terisolasi dapat digunakan untuk pendekatan tampilan IB seperti yang diuraikan di atas, juga dapat berfungsi sebagai jangkar untuk menampilkan target imobilisasi pada permukaan granula PHA. Selain PhaC, beberapa phasin seperti PhaF/PhaP juga terbukti terlokalisasi pada butiran PHA dan, oleh karena itu, dapat digunakan untuk tampilan POI [9], yang dicapai dengan menggabungkan gen pengode POI dengan gen pengode PhaC/PhaF/PhaP secara langsung, atau menggabungkan berbagai tag umpan-mangsa [75, 76], dengan protein fusi yang kemudian diproduksi secara berlebihan pada organisme yang mampu melakukan sintesis PHA.
Cry3Aa adalah protein pembentuk kristal dari Bacillus thuringiensis, yang memiliki toksisitas terhadap serangga tertentu. Selain penggunaan pestisida yang terkenal, kristal Cry3Aa, yang dapat berukuran hingga 1 µm, juga dapat digunakan untuk penjebakan POI [9]. POI dan Cry3Aa dapat diproduksi bersama untuk memungkinkan penjebakan target tanpa perlu fusi genetik [77], namun, fusi genetik cry3aa dan gen yang mengkode POI juga dapat secara kovalen menempelkan POI di dalam kristal Cry3Aa [78, 79].
VLP (ukuran antara 20 dan 200 nm) terdiri dari protein kapsid virus (CP) yang mampu merakit diri, yang dapat digunakan untuk menjebak atau menampilkan POI [80, 81]. Untuk enkapsulasi, gen target imobilisasi digabungkan dengan gen yang mengkode CP virus, yang kemudian dapat merakit diri dan dengan demikian menjebak POI (misalnya, kapsid virus belang klorotik Cowpea), atau, gen yang mengkode POI digabungkan dengan gen yang mengkode protein perancah yang terlibat dalam perakitan kapsid dan memungkinkan penjebakan POI di dalam bagian dalam kapsid (misalnya, virus Salmonella P22 [82-85]). Selain enkapsulasi atau penjebakan oleh VLP, POI juga dapat ditampilkan ke permukaan kapsid, yang dapat dicapai dengan merekayasa CP untuk mengakomodasi perlekatan pasca-translasi POI, yang menghasilkan VLP yang dihiasi dengan POI [9, 81, 86]. Mirip dengan pendekatan lain, pasangan E-/K-coil dan SpyTag/SpyCatcher umumnya dikombinasikan dengan pendekatan imobilisasi berbasis VLP [84, 87, 88], dan VLP termagnetisasi juga ada (lihat Bagian 4.1.2)
Terakhir, LLPS dapat berfungsi sebagai metode imobilisasi, di mana oligomerisasi, efek kepadatan makromolekul, dan sering kali keberadaan protein/wilayah yang tidak teratur secara intrinsik mengakibatkan pembentukan fase encer, yang secara spontan terlepas dari larutan, membentuk kondensat protein sebagai fase yang dapat diisolasi [9, 89, 90]. Protein tertentu seperti DDX3 RNA helicase dan protein sutera laba-laba spidroin 1 mengandung daerah yang tidak teratur secara intrinsik (masing-masing domain RGG dan I16 [91, 92]), yang dapat digabungkan secara bersamaan untuk memicu LLPS, dan kemudian dapat digunakan untuk mengarahkan POI ke kondensat protein melalui motif interaksi protein umpan-mangsa, atau penggabungan langsung gen yang mengkode POI ke protein yang tidak teratur secara intrinsik tersebut. Protein atau domain yang tidak teratur secara intrinsik dapat digabungkan lebih lanjut ke fotoreseptor tertentu, yang mengalami oligomerisasi setelah pencahayaan, seperti kriptokrom (Cry2/Cry2Olig) [93] dan protein flavin yang menggunakan cahaya biru (BLUF) (misalnya, PixE/D) [94] untuk memungkinkan LLPS yang bergantung pada cahaya.
Karena keserbagunaannya, bahan magnetik, yang mengandung, misalnya, besi, nikel, dan kobalt yang merespons medan magnet, digunakan secara luas dalam berbagai industri. Aplikasi magnet sudah lama bersifat teknis (perangkat pintar, penyimpanan data, aplikasi penginderaan) [95] tetapi meluas ke biomedis (pengiriman obat, pencitraan) [96] dan bioteknologi (imobilisasi enzim, pengolahan air limbah) [28, 97]. Untuk memahami sifat-sifat magnet, kita perlu memahami bahwa magnet dapat memberikan informasi yang berguna untuk kehidupan sehari-hari.
3 Bahan Pembawa Magnetik (Nano) Konvensional untuk Imobilisasi Enzim
3.1 Sifat Umum Bahan Pembawa Magnetik Konvensional
Dalam bidang biokatalisis/bioteknologi, bahan pembawa magnetik dengan berbagai ukuran, mulai dari nanopartikel magnetik (MNP) hingga MB yang lebih besar (juga dikenal sebagai partikel magnetik atau mikrosfer magnetik), telah banyak digunakan untuk imobilisasi enzim [21, 28, 103–105]. Demikian pula, partikel magnetik hadir dalam berbagai bentuk, mulai dari MNP dan MB yang paling banyak digunakan dengan morfologi bulat hingga nanopartikel anisotropik seperti kubus, batang, cakram, bunga, tetapi juga arsitektur yang lebih kompleks seperti bola berongga, bintang, tetrapoda atau nanoplatelet, dan sebagainya [106, 107]. Sementara partikel dengan ukuran yang lebih kecil, karena rasio permukaan terhadap volume yang lebih besar, menyediakan lebih banyak tempat pengikatan untuk imobilisasi enzim dan karenanya memungkinkan pemuatan yang lebih baik, partikel yang lebih besar lebih mudah dipulihkan secara magnetik. Selain itu, bentuk nanomaterial yang digunakan dapat memengaruhi aktivitas enzimatik secara signifikan. Nanotube dan nanostruktur lainnya, karena ukurannya yang lebih kecil, menunjukkan jari-jari kelengkungan yang lebih besar, sehingga membantu mengurangi interaksi protein-ke-protein yang tidak diinginkan dengan memungkinkan jarak pusat-ke-pusat yang lebih besar antara molekul enzim yang diimobilisasi yang berdekatan [108]. Sebagai kesimpulan, baik ukuran maupun bentuk berperan penting untuk imobilisasi enzim yang efisien dan pemulihan magnetik untuk memungkinkan daur ulang imobilisasi yang efisien [21]. Lebih jauh, seperti halnya semua metode imobilisasi, kerapatan muatan dan cara perlekatan pada penyangga (misalnya, perlekatan kovalen vs. pengikatan adsorpsi/afinitas) dan dengan demikian perbedaan terkait dalam kekuatan pengikatan, daya tahan, dan penggunaan kembali imobilisasi magnetik memainkan peran penting dalam menentukan efisiensi metode imobilisasi. Hal ini tidak hanya berlaku untuk imobilisasi MNP/MB yang disajikan berikut ini, tetapi juga meluas ke imobilisasi enzim magnetik yang diproduksi secara in vivo (lihat Bab 4), di mana parameter ini bahkan lebih sulit untuk dikontrol. Masalah penting lainnya untuk memungkinkan imobilisasi enzim yang efisien adalah fungsionalisasi permukaan partikel magnetik, yang dapat secara signifikan memengaruhi afinitas enzim, pemuatan enzim, stabilitas enzim imobilisasi magnetik, serta kecenderungan pelindian (yaitu, hilangnya enzim karena fiksasi yang tidak tepat), dispersibilitas, kelarutan, dan biokompatibilitas partikel [109]. Sebagai kesimpulan, optimalisasi sifat-sifat ini dapat memberikan bahan pembawa yang lebih baik untuk aplikasi dalam biomedis dan biokatalisis. Karena ada ulasan terkini yang sangat bagus yang telah membahas topik-topik ini (lihat, misalnya, Melo et al. [104], Holyavka et al. [110], Cavalcante et al. [21], Papatola et al. [27], Comanescu [109]), dan fokus ulasan ini adalah pada enzim imobilisasi magnetik yang diproduksi secara biologis, kami hanya akan memberikan tinjauan singkat (tidak lengkap), yang berfokus pada perkembangan terkini.
3.2 Manik Magnetik (MB) untuk Imobilisasi Enzim
Saat ini, metode yang paling sederhana dan mudah untuk mengimobilisasi enzim pada bahan pembawa magnetik adalah imobilisasi berbasis bioafinitas pada MB komersial. Untuk sistem MB tersebut, pengikatan afinitas umumnya bergantung pada penggunaan pendukung yang diaktifkan (misalnya, streptavidin, kelat logam yang terikat sebagai ligan ke permukaan MB) dan tag polipeptida pendek atau protein utuh yang menyatu dengan POI yang mengikat ligan yang ditampilkan oleh pendukung. Sistem MB yang tersedia secara komersial, yang lebih besar dari MNP (250 nm hingga 30 µm) [111, 112] biasanya terdiri dari agarosa yang terikat silang yang membungkus inti feromagnetik atau ferrimagnetik (biasanya magnetit). Selain itu, jenis pelapis polimer lainnya dapat digunakan, termasuk di antaranya, polivinilalkohol, kitosan, dan alginat [113] (Gambar 3). MB komersial tersedia dengan beragam ligan seperti Ni2+ yang dikelat NTA (untuk protein berlabel His), glutathione (untuk protein berlabel glutathione-S-transferase), protein A/G untuk imunopresipitasi dan streptavidin (untuk protein berlabel Strep atau yang terbiotinilasi) [114-118]. Alternatifnya, dan secara tradisional lebih umum, adalah imobilisasi kovalen enzim/protein pada penyangga padat (magnetik) [119], yang dicapai dengan menghubungkan secara kovalen gugus fungsi yang melapisi penyangga padat (misalnya, gugus epoksi, karboksil, amina, atau aldehida) dan residu asam amino yang ada pada permukaan enzim [119].
